产品简介

MycAway®支原体qPCR检测试剂盒(探针法)是基于NAT(nucleic acid amplification techniques)的一种快速定性检测生产原料、细胞库、病毒种子、病毒或细胞收获液、治疗用细胞中潜在支原体污染的产品。该试剂盒基于定量PCR技术，采用多重PCR的方法，使用2种荧光探针，FAM和CY5，分别检测目标序列和内参。其可覆盖183种支原体DNA序列，并且严格按照EP 2.6.7进行专属性、检测限、耐用性验证，检测限满足≤10 CFU/mL的要求，具备灵敏度高、特异性好、安全性好等特点。

本产品能够与利用手动提取方法的MolPure®磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒（Cat#18461ES）搭配使用。样本中的核酸同样也可以使用Auto-Pure 32A全自动核酸提取仪（Cat#80501ES）和MolPure®磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒FA(预封装)（Cat#18462ES）自动提取样本核酸（请注意，试剂盒货号Cat#18461ES和Cat#40619ES都已经过完全验证，如需详细验证信息，可以联系我司技术支持）。样本经过前处理去除干扰杂质获得纯化的支原体DNA后，使用qPCR仪进行qPCR反应后收集探针的荧光信号，从而对检测结果进行分析。

产品信息

组分信息

^*内部对照（IC）：Internal control；

^**阳性对照（PCS）：Positive control solution，浓度为1,000 copies/µL；

^***DNA稀释液：用于样本和IC稀释，以及NTC和NCS的模板。

储存条件

-25~-15℃保存，有效期2年。

*收到货后，请检查各组分是否齐全，如不立即开封各组分做实验，需立即放入-25~-15℃中保存。注意40619-B需要避光保存。

使用说明

1. 实验前准备

1）提前准备实验所需试剂耗材；

2）确认仪器适配性：

本试剂盒适配的qPCR机型包含但不限于以下仪器：

a. SLAN: 96S;

b. Thermo Scientific: 7500 Real-Time PCR System, QuantStudio™ 5;

c. Roche: LightCycler® 480.

1. 实验方法

1）待测样本DNA提取

建议使用Yeasen的“磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒”提取样本DNA，产品货号为Cat#18461ES（用于手动提取）和Cat#18462ES（用于自动提取），您可以在翌圣官网（https://www.yeasen.com）查询该产品的详细信息和购买该产品。

2）qPCR反应体系的准备

a. 根据所要检测样本的数量，包括阳性对照(PCS)^*、无模板对照(NTC)^**、抽提阴性对照(NCS)^***和待测样本(TS)^****，根据实验设计，计算所需反应孔数，一般每个样本做2个重复孔。

^*阳性对照（PCS）：Positive control solution；

^**无模板对照（NTC）：No template control；

^***抽提阴性对照（NCS）：Negative control solution；

^****待测样本（TS）：Test sample。

^*****PCS和NTC为无需进行提取前处理的样本；NCS和TS为需要进行提取前处理的样本。

反应孔数 =（1×PCS + 1×NTC+ 1×NCS + N×TS）×2

b. 根据实验设计以及下面对应表格中的反应体系，提前将所需试剂放置室温融化。

c. 根据实验设计和反应孔数计算所需要的qPCR Mix的量。

若用户不做对照样品，则在计算反应孔数的时候进行相应删减即可。

表1 qPCR Mix体系

SLAN仪器所用体系

表2 SLAN仪器qPCR Mix体系

3）加样

a. 充分震荡混匀qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。

b. 向每孔反应管中分装20μL对应样本的qPCR Mix。注意，各样品管中分装的qPCR Mix需要与上一步“qPCR反应体系的准备”中配制的qPCR Mix保持一致，与样品一一对应，避免加错。

c. 向已分装过qPCR Mix的反应管中加入样品。

表3 加样示例^***

^*NCS推荐使用DNA稀释液作为样本进行前处理。

^**注意盖上反应管盖子或者贴上光学膜，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。

^****完成加样后，先短时低速离心反应管或反应板，如有气泡，排尽气泡后低速离心，不需振荡混匀。

4）qPCR程序参数设置

a. 程序文件设置：

以Thermo Scientific: 7500 Real-Time PCR System仪器和Real-Time PCR Software v2.4为例：

仪器类型：7500 (96 Wells)

实验类型选择：Quantitation-Standard Curve

检测目标序列的试剂：Taqman® Reagents

程序速度：Standard (~70 min to complete a run)

b. 检测通道设置：

在“Plate Setup”的“Define Targets and Samples”中，创建Target 1通道（FAM），选择报告荧光基团为FAM，猝灭荧光基团为MGB或None；创建Target 2通道（CY5），选择报告荧光基团为CY5，猝灭荧光基团为None。在“Plate Setup”的“Assign Targets and Samples”中，选择“None”。

c. 标准扩增程序设置：

表4 标准扩增程序

d. 基线和阈值设置：

基线调整原则：仪器默认基线。

阈值设置原则：Thermo Scientific: 7500 Real-Time PCR System仪器阈值线手动设置为50000。其他仪器类型不需要进行阈值线调整，用仪器默认参数。

图1 7500基线阈值线参数

5）结果分析

a. PCS、NTC和NCS结果判断:

表5 PCS、NTC和NCS结果判断

^*若各样品进行2重复以上检测，则每个重复孔都需要满足上述条件，如果有个别孔不满足，建议调查原因后重新测试。

b. 待测样本TS检测结果判断：

前提条件：判断待测样本TS检测结果前，需要先判断各质控品即PCS、NTC和NCS是否通过表4中的标准。若通过则可以进行下一步；若未通过，则待测样本TS的结果可能不可靠，需要调查原因。

表6 待测样本结果判断^**

^*CY5信号如果有抑制，如需要，建议调查并对样本进行合适处理消除抑制因子后重测。

^**若各样品进行2重复以上检测，则每个重复孔都需要满足上述条件，如果有个别孔不满足，建议调查原因后重新测试。

注意事项  

1）使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2）加样和配液步骤都尽量在冰上操作。

3）每个组分在使用前都应震荡混匀，低速离心。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途。

Ver.CN20240305