产品简介

MycAway™ 支原体 qPCR 检测试剂盒(探针法)是基于 NAT(nucleic acid amplification techniques)的一种快速定性检测生产原料、细胞库、病毒种子、病毒或细胞收获液、治疗用细胞中潜在支原体污染的产品。该试剂盒基于定量 PCR 技术，采用多重 PCR 的方法，使用 2 种荧光探针，FAM 和 VIC，分别检测目标序列和内参。可覆盖 100 多种支原体 DNA 序列；并且严格按照 EP 2.6.7 进行专属性、检测限、耐用性验证，检测限满足≤10 CFU/mL 的要求，具备灵敏度高、特异性好、安全性好等特点。

本产品能够与利用手动提取方法的 MolPure® 磁珠法残留 DNA 样本前处理试剂盒（Cat#18461）搭配使用。样本中的核酸同样也可以使用 Auto-Pure 32A 全自动核酸提取仪（Cat#80501）和 MolPure® 磁珠法残留DNA 样本前处理试剂盒 FA(预封装)（Cat#18462）自动提取样本核酸（请注意，试剂盒货号 Cat#18461 和 Cat#C230106 都已经过完全验证，如需详细验证信息，可以联系我司技术支持）。样本经过前处理去除干扰杂质获得纯化的支原体 DNA 后，使用qPCR 仪进行 qPCR 反应后收集探针的荧光信号，从而对检测结果进行分析。

产品规格

组分信息

* 内部对照（IC）：Internal control；

** 阳性对照（PCS）：Positive control solution，浓度为 1,000 copies/µL；

*** DNA 稀释液：用于样本和 IC 稀释、以及 NTC 和 NCS 的模板；

**** 超纯水：用于制备 qPCR Mix 体系。

运输与储存

25~-15℃保存，有效期 1 年。

*收到货后，请检查各组分是否齐全，如不立即开封各组分做实验，需立即放入-25~-15℃中保存。注意 C230106-B 需要避光保存。

使用说明

1.实验前准备

1)提前准备实验所需试剂耗材；

2)确认仪器适配性：

本试剂盒适配的 qPCR 机型包含但不限于以下仪器：

A:Bio-Rad: CFX96

B:Thermo Scientific: 7500 Real-Time PCR System；QuantStudio™ 5；

2.实验方法

1）待测样本 DNA 提取

建议使用 Arcegen 的“磁珠法残留 DNA 样本前处理试剂盒”提取样本 DNA，产品货号为 Cat#18461ES（用于手动提取）和Cat#18462ES（用于自动提取），您可以在Arcegen官网查询该产品的详细信息和购买该产品。本试剂盒（Cat#C230106ES）中包含内部对照（IC）。如果在 DNA 提取前将 IC 加入样品中，可以验证整个过程（包括 DNA提取和 qPCR 反应）。如果将 IC 直接添加到qPCR Mix 中，IC 将仅作为 qPCR 对照。

2）qPCR 反应体系的准备

a.根据所要检测样本的数量，包括阳性对照（PCS），无模板对照（NTC），抽提阴性对照（NCS）和待测样本（TS），  根据实验设计，计算所需反应孔数，一般每个样本做 2 个重复孔。

*阳性对照（PCS）：Positive control solution；无模板对照（NTC）：No template control；抽提阴性对照（NCS）：Negative control solution；

待测样本（TS）：Test sample。PCS 和 NTC 为无需进行提取前处理的样本；NCS 和 TS 为需要进行提取前处理的样本。

反应孔数（M1）=（1×NCS + N×TS）×2

反应孔数（M2）=（1×PCS + 1×NTC）×2

反应孔数（M3）=（1×PCS + 1×NTC+ N×TS）×2

b.根据实验设计以及下面对应表格中的反应体系，提前将所需试剂放置冰上融化。

c.根据反应孔数计算所需要的qPCR Mix 的量。注意，如果使用该产品用于产品放行等 GMP 活动中，则推荐按照表 1 和表 2 配置体系；如果仅用于研发实验中，用户自行评估实验情况后认为无需提取前将IC 加入 TS 中或无需做 NCS 对照，也可按照表 3 配置体系。并非 M1，M2，M3都需要配制。

表 1 反应孔数（M1）对应的 qPCR Mix 体系

*表 1 中的配置体系是基于 NCS 和 TS 都是在提取前加入 IC 的前提下，则无需在配置 qPCR Mix 时再加入 IC。提取前加入 IC 的方法：首先将试剂盒 IC 用 DNA 稀释液稀释 20 倍，每 100 μL 检测样本加入 1 μL 稀释后的 IC 后进行提取。

**本试剂盒不含 ROX 参比染料，若您目前使用的 Real Time PCR 扩增仪需要添加 ROX 参比染料，推荐您购买本公司的 50× ROX Reference Dye

（Cat#10200ES），以使用本产品为例，添加体积为 0.8 μL，见表 1。如果使用其他品牌的 ROX 产品，请具体参考其说明书进行 ROX 添加。若不需要添加 ROX 参比染料，则添加体积为 0 μL。

表 2 反应孔数（M2）对应的 qPCR Mix 体系

*表 2 中的配置体系是基于 PCS 和 NTC 都是未在提取前加入 IC 的前提下，则需要在配置 qPCR Mix 时加入 IC。提取后加入 IC 的方法：将 IC 用 DNA稀释液稀释 100 倍后每个反应体系中加 1 μL。

**本试剂盒不含 ROX 参比染料，若您目前使用的 Real Time PCR 扩增仪需要添加 ROX 参比染料，推荐您购买本公司的 50× ROX Reference Dye

（Cat#10200ES），以使用本产品为例，添加体积为 0.8 μL，见表 2。如果使用其他品牌的 ROX 产品，请具体参考其说明书进行 ROX 添加。若不需要添加 ROX 参比染料，则添加体积为 0 μL。

表 3 反应孔数（M3）对应的 qPCR Mix 体系

*表 3 中的配置体系是基于提取前样本中不加入 IC 的前提下，则需要在配置 qPCR Mix 时加入 IC。提取后加入 IC 的方法：将 IC 用 DNA 稀释液稀释 100 倍后每个反应体系中加 1 μL。

**本试剂盒不含 ROX 参比染料，若您目前使用的 Real Time PCR 扩增仪需要添加 ROX 参比染料，推荐您购买本公司的 50× ROX Reference Dye

（Cat#10200ES），以使用本产品为例，添加体积为 0.8 μL，见表 3。如果使用其他品牌的 ROX 产品，请具体参考其说明书进行 ROX 添加。若不需要添加 ROX 参比染料，则添加体积为 0 μL。

3)加样

A.充分震荡混匀 qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。

B.向每孔反应管中分装 20μL 对应样本的 qPCR Mix。注意，各样品管中分装的 qPCR Mix 需要与上一步“qPCR 反应体系的准备”中配置的 qPCR Mix 保持一致，与样品一一对应，避免加错。

 C.向已分装过qPCR Mix 的反应管中加入样品，参考表 4。

**每管或孔中最终反应体积为 40μL。

*NCS 推荐使用 DNA 稀释液作为样本进行前处理。

表 4 加样示例

***注意盖上反应管盖子或者贴上光学膜，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。

****完成加样后，先短时低速离心反应管或反应板，再充分震荡混匀然后短时低速离心，将管盖和管壁的残留液体收集至管或板底。操作时尽量避免气泡产生。这一步非常重要，不混匀或者混匀不彻底会影响基线平稳。

4)qPCR 程序参数设置

A.程序文件设置：

以 Thermo Scientific: 7500 Real-Time PCR System 仪器和 Real-Time PCR Software v2.4 为例：仪器类型：7500 (96 Wells)

实验类型选择：Quantitation-Standard Curve；检测目标序列的试剂：Taqman® Reagents

程序速度：Standard (~2 hours to complete a run)

B.检测通道设置：

在“Plate Setup”的“Define Targets and Samples”中，创建 Target 1 通道（FAM），选择报告荧光基团为FAM，猝灭荧光基团为 MGB 或none；创建 Target 2 通道（VIC），选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none。在“Plate Setup”   的“Assign Targets and Samples”中，如果没有额外加入 ROX 染料，则选择“none”；如果额外加入了 ROX，则选择“ROX”。

c. 标准扩增程序设置：

表 5 标准扩增程序

d. 基线和阈值设置：

基线调整原则：基线通常按照自动设置的基线即可。如需手动调整，基线起始循环数选择在指数增长期之前，其中起点设置需要避开起始荧光采集的波动区，终点选择在最早出现指数扩增样本的 Ct 值的前 1-2 个循环。

阈值设置原则：通常采用自动阈值。如需手动调整，阈值线要高于阴性对照或者基线噪音，通常设置在样本重复性较好的指数增长期的后期，不同通道需要设置相对独立的、合适的阈值线。

5）结果分析

a.PCS、NTC 和NCS 结果判断:

若反应体系中加入了 IC，则各质控样品需要满足表 6 中条件：

表 6 PCS、NTC 和 NCS 结果判断

若反应体系中未加 IC：各质控样品需要满足表 6 中 FAM 信号一列的条件，无需分析 VIC 通道。

b.待测样本 TS 检测结果判断：

前提条件：判断样本 TS 检测结果前，需要先判断各质控品即 PCS、NTC 和 NCS 是否通过表 6 中的标准。若通过则可以进行下一步；若未通过，则样本 TS 的结果可能不可靠，需要调查原因。

若反应体系中加入了 IC，则根据样本FAM 信号和 VIC 信号的结果找到表 7 中对应的结果判断：

表 7 待测样本结果判断（加 IC 时）

*VIC 信号如果有抑制，需重测或对样本进行合适处理消除抑制因子

若反应体系中未加 IC：无需分析 VIC通道，只需要根据表8中样本FAM信号的结果找到对应的结果判断：

表 8 待测样本结果判断（未加 IC时）

注意事项

1）使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2）加样和配液步骤都尽量在冰上操作。

3）每个组分在使用前都应震荡混匀，低速离心。

4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5）本产品仅作科研用途。