近期四川大学华西医院肿瘤生物治疗国家重点实验室在 HEPATOLOGY 杂志上发表题为“Extrachromosomal circular MiR-17-92 amplicon promotes hepatocellular carcinoma”的原创性论文。在这项研究中，利用Circle-seq的方法，探究了人HCC中eccDNAs的综合特征，eccDNA在HCC肿瘤中高度富集，优先来源于某些染色体热点，并且与差异基因表达相关。文章通过PCR和sanger测序验证了一系列携带Micro RNA-17-92簇的eccDNA。定量PCR分析显示，含有microRNA-17-92的eccDNA及其相应的microRNA的表达在HCC肿瘤中升高，并且与HCC患者的不良结局和年龄相关。通过连接酶辅助的微环积累方法（LAMA）合成的含有miR-17-92簇的人工DNA环的外源表达可以显著加速HCC细胞增殖和迀移。并证明了含有microRNA 17 -92的eccDNAs在肿瘤进展中的致癌作用。
发表期刊：HEPATOLOGY
影响因子：17.298/Q1
发表时间：2023年5月1日
期刊ISSN：0270-9139
研究方法：ecc DNA Circle-seq、eccDNA Sanger 测序等
技术路线
研究内容
1、人肝癌eccDNA的全基因组特征：采用Circle-seq方法在基因组规模上鉴定HCC eccDNA，从肿瘤组织和相邻非肿瘤组织的样品中纯化和富集环状DNA，质粒安全DNA酶处理去除线性DNA，滚环扩增，对双端读段进行测序并映射到人类基因组。总共鉴定了238781个eccDNA。
接下来，通过基因注释分析eccDNAs的染色体来源的性质。发现156016个eccDNAs可以定位到基因区域（99077个来自肿瘤样品; 56939个来自非肿瘤样品），而剩余的82765个eccDNA不与任何已知的基因区域重叠。对基因类型的进一步分析显示，在两组中，约50%的eccDNA含有蛋白质编码基因，随后约25%的eccDNA含有长非编码RNA（lncRNA）。参与原癌途径的许多癌基因，如AKT、STAT 3、MAPK、NOTCH和WNT，在HCC eccDNA中富集对肿瘤发生具有因果影响。此外，eccDNA也被定位到重复序列，并且它们中的大多数起源于短散在重复序列和长散在重复序列，这些结果表征了肝组织中eccDNA的全基因组谱，并表明eccDNA可能参与HCC发病机制。
2、人HCC eccDNA的染色体分布
为了深入了解HCC中eccDNAs断点的特征，将断点的坐标映射到基因组。断裂点的染色体分布类似于eccDNA序列的染色体分布，但HCC肿瘤中的断裂点密度高于非肿瘤样品的断裂点密度。然而，在HCC肿瘤中共同断裂点的数目（eccDNA之间90%的相互重叠）减少，这可能是由于癌细胞中增加的异质性和可塑性。值得注意的是，当将重叠率从90%降低至10%时，肿瘤中常见eccDNA断裂点的数目高于非肿瘤样品中的数目，表明HCC的基因组不稳定性增强。
3、人肝癌组织中ECcDNA携带基因的差异表达
鉴于人类HCC中差异表达的eccDNA基因在疾病发病机制中具有重要的意义，在这篇研究中，共发现肿瘤和非肿瘤样本中存在649个差异表达eccDNAs，其中534个在HCC中上调（>2倍），而115个下调（< 0.5倍）。最近的研究已经表明eccDNA与癌基因扩增和癌症进展呈正相关。本研究中使用了TCGA和GTEx数据库分析了前20个上调的eccDNA基因的表达，发现这20个上调基因中的19个（95%）源自13号染色体，其在HCC中表现出过度的不稳定性。
4、miR-17-92簇富集在来自HCC的eccDNA中
GO富集分析显示，这些基因与基因表达的负向调控、miRNA介导的翻译抑制、RNA诱导的沉默复合物（RISC）和基因沉默mRNA过程相关，并且与miRNA调控密切相关。KEGG途径分析进一步显示，癌症中包含miR-17-92簇的miRNA是最显著的失调途径。与非肿瘤eccDNA相比，miR-17-92簇的六个成员（miR-17、miR-18 a、miR-19 a、miR-19 b-l、miR-20 a和miR-92 a-l）的HCC eccDNA显著增加。
本研究通过LAMA方法产生合成的DNA环—miR-17-92eccDNA，将其命名为MIR 17 HGCircle，来探究其转录物在人体细胞中的功能。MIR 17 HGCircle包含共有序列（3330 bp，chr 13：9135045791353786），其具有整个miR-17-92簇。在连接循环后成功获得双链MIR 17 HGcircle分子，并且通过PCR和桑格测序验证结构。此外，MIR 17 HGCircle产物对质粒安全的DNA酶处理具有抗性，表明其具有完整的闭合环状DNA结构。这些结果表明，人工MIR 17 HG环分子可用于功能性模拟含MIR 17 HG的eccDNA。
6、MIR17HGcircle促进HCC细胞生长和转移
在功能测量之前，首先验证了人工MIR17HGcircle分子可以在细胞中转录。与阴性对照相比，MIR17HGcircle的转染导致Huh7和SNU-449细胞中的初级miR-17 - 92转录物（pri-miR-17 - 92）增加约15倍，以及miR-17 - 92前体（pre miR）的不同成员增加2至40倍。重要的是，成熟miR-17 - 92家族成员（如miR-17 - 5p和miR-18a-5p）的水平在用MIR17HGcircle转染的HCC细胞中显著增加，增强MIR17HGcircle分子的转录活性。
通过构建荧光素酶编码序列报告载体，再经过MIR 17 HGcircle转染，对miR-17-92簇中的五个已知靶标，即CDHl（也称为E-钙粘蛋白）、PTEN、GSK 3 β、P21和BIM，进行实验验证，结果表明这些靶标的mRNA和蛋白质水平显著降低。此外，MIR 17 HGcircle的转染导致HCC细胞生长、迀移，和侵袭的显著增加，与miR-17-92簇的公认功能一致。值得注意的是，miR-17- 5 p或miR-18 a-5 p的抑制显著减弱MIR 17 HGcircle诱导的HCC细胞生长和转移，表明miR-17-92簇可以介导MIR 17 HGcircle的作用。总之，这些数据表明人工MIR 17 HG环分子可以被有效地转录并促进HCC细胞生长和转移，表明含有MIR 17 HG的eccDNA的致癌作用。
7、miR-17-92的eccDNAs增加可能会促进HCC进展
文章分析了含miR-17-92的eccDNAs与肝癌患者临床特征之间的潜在相关性。采用TCGA数据库的Cox比例风险模型揭示了MIR 17 HG拷贝数是肝癌患者生存率的独立风险因素。使用对数秩测试进行KaplanMeier分析也显示MIR 17 HG的扩增拷贝数与肝癌患者存活概率呈负相关。此外，进行斯皮尔曼相关性和单变量逻辑回归分析来评估MIR 17 HG和miR-17-92表达与肝癌临床特征之间的关系，结果显示MIR 17 HG和miR-17-92家族成员的表达都与肝癌患者的年龄负相关，表明它们可能作为早期肝癌的危险因素。其中，MIR 17 HG显示最强的相关性，而miR-18 a-5 p是miR-17-92家族中与患者年龄相关最突出的成员。此外，还观察到miR-17-92表达与病毒感染之间的正相关性，以及MIR 17 HG表达与肝纤维化之间的正相关性。
总 结
这篇研究报告了HCC中eccDNA的全基因组谱，并证明了携带miR-17-92的eccDNA在HCC进展中的重要性，共同建立了eccDNA与HCC发病机制之间的联系。研究结果扩展到各种癌症类型，对癌症生物学和治疗有很大的参考价值。云序生物eccDNA相关产品
1.组织细胞环状DNA测序
云序生物基于circle-seq的方法，采用多种手段包括柱纯化去除基因组DNA、酶消化去除线性DNA和线粒体DNA、滚环扩增放大信号，高效地纯化和富集环状DNA，再利用NGS测序和生信分析识别环状DNA。结合优化的实验流程，本环状DNA测序服务具有检出率高﹑准确性好等优点。
技术优势：
使用原装A&A Biotechnology纯化柱高效富集环状DNA
滚环扩增放大环状DNA信号，提高检出率
专业的生信分析：详尽的注释、丰富的图表
云序生物eccDNA测序实验示意图
2.体液样品环状DNA测序针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品，云序生物参考卢煜明教授团队开发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开eccDNA环状结构并同时在DN**段两端加上接头，进行建库及测序。Tn5转座酶法效率高，损耗低，实现血液循环系统中微量的环状DNA的检测。并且本产品能保留环状DNA的原始表达量，使得不同环状DNA间的表达量的比较更为准确。
技术优势：
减少DNA损失
保留原始表达量，不同环状DNA间表达量比较更准确
3.体液样品环状DNA甲基化测序
针对血清、血浆、尿液、脑脊液等微量的体液样品，云序参考卢煜明教授团队 2021 年研发的方法，酶切去除线性DNA后，利用Tn5转座酶，打开环状DNA环状结构并同时在DN**段两端加上接头，并用酶转化法将未甲基化的C转化为U，进行建库及测序。一次建库测序中同时检测样品中环状DNA及其甲基化位点的信息。
一箭双雕：同时检测环状DNA及其甲基化状况，节约样品，性价比高
单碱基分辨的环状DNA甲基化分析
4.环状DNA sanger测序
针对测序项目中筛选出的环状DNA，云序提供sanger测序服务验证环状结构。其主要目的在于：为用户提供一种低成本的扩大样品量验证手段，节约实验成本。通过设计反向引物进行PCR扩增，将覆盖环状DNA连接位点的扩增产物进行sanger测序，验证连接位点处序列。
5.A&A Biotechnology 环状 DNA 纯化柱
A&A Biotechnology的纯化柱，是绝大部分环状DNA高分文章中所使用的纯化柱。云序生物是该品牌在国内的唯一总代理。
云序生物服务优势
优势一：国内率先提供环状DNA测序服务和环状DNA甲基化测序的公司，同时也是首家有客户发表 10 分以上 eccDNA 论文的公司。优势二：拥有包括组织细胞/体液样品环状DNA测序服务和环状DNA甲基化测序在内丰富的环状DNA测序产品线。
优势三：A&A Biotechnology 总代理，采用原装A&A Bio纯化柱，环状DNA 纯化效果好。
优势四：一站式服务：您只需按照送样要求向云序生物寄送样品，我们就能为您完成从环状DNA 提取，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。
优势五：严格质控流程：云序生物质控流程严格，层层把关，为客户提供高准确度的结果。
优势六：专业化生物信息分析：云序生物强大生物信息团队，满足客户个性化数据分析要求。
往期回顾
云序用户通过circle-seq在家蚕中发现具有重要功能的 eccDNA
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