发表期刊：Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology（IF=9.225）
作者院校：上海交通大学医学院附属新华医院
技术路线图
人粪样品：埃希氏菌属与 NAFLD 病症严重程度正相关
通过对 NAFLD 患者（n=29）以及健康志愿者（n=25）的粪便样品进行 16S rRNA 基因（rDNA）测序，研究者发现了 NAFLD 患者的肠道微生物菌群的特征。观察不同属（genus）的肠道微生物的相对丰度，作者发现，埃希氏菌属（Escherichia_Shigella）与 NAFLD 严重程度正相关：1.肠道菌群中埃希氏菌属的比例，在 NAFLD 患者中高于健康志愿者；
2.肠道菌群中埃希氏菌属的比例，在健康志愿者、超重（但未达到“肥胖”标准）患者、肥胖患者当中递增；
3.肠道菌群中埃希氏菌属的比例，在健康志愿者、轻度脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver, NAFL）、重度脂肪肝炎症（Nonalcoholic steatohepatitis, NASH）患者当中递增；
4.肠道菌群中埃希氏菌属的比例，在健康志愿者、肝组织无纤维化的患者、肝组织纤维化的患者当中递增。
针对埃希氏菌属和 NAFLD 病症严重程度进行的 Spearman 相关分析也证明，二者之间确实存在正相关关系。
图1 埃希氏菌属所占比例与NAFLD 严重程度正相关。粉红**域**埃希氏菌属。
大鼠实验：埃希氏菌属中的 Escherichia fergusonii 可引发非肥胖 NAFLD 的病理特征
在埃希氏菌属中的 7 个物种当中，有一种致病菌 Escherichia fergusonii 可以**包括人类和大鼠在内的多个物种。作者发现，16 个星期的 E. fergusonii 喂食， 可改变大鼠的肠道菌，并且对大鼠肝脏的解剖学特征产出改变：相比于对照组，经过 E. fergusonii 喂食的大鼠的肝脏更大，颜色更暗淡，显微观察则还可以发现肝细胞气球样变（hepatocellular ballooning）以及脂肪积累（lipd droplet accumulation）——这些病理特征与高脂高胆固醇喂食的大鼠肝脏相似，但是 E. fergusonii 喂食的大鼠并未出现体重的**上升，因此是一种非肥胖的NAFLD 病理特征。除此之外，肝中的甘油三酯水平、胆固醇水平、附睾中的脂肪水平、肝指数（liver index）等指标也显示出 E. fergusonii 喂食的大鼠与高油高胆固醇喂食的大鼠之间的相似性。以上这些大鼠实验的结果均可说明，埃希氏菌属中的 Escherichia fergusonii 可引发非肥胖 NAFLD 的病理特征。
图2 E. fergusonii喂食组大鼠的肝脏解剖学特征、肝细胞气球样、脂肪积累现象与高脂高胆固醇喂食的大鼠肝脏相似。
大鼠实验：Escherichia fergusonii 可导致部分大鼠患上 NASH
非酒精性脂肪肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis, NASH）是 NAFLD 的恶化形式。高脂高胆固醇喂食的大鼠表现出了典型的脂肪肝炎病症，包括纤维化水平上升、谷草转氨酶和谷丙转氨酶水平上升、ROS 水平上升等。在10 只高脂高胆固醇喂食的大鼠当中，有 7 只的肝组织纤维化分数>1。而在 E. fergusonii 喂食的 10 只大鼠当中，有 2 只的肝组织纤维化分数>1，另有 2 只大鼠的肝脏有明显的肝小叶炎症反应，因此共计有 4 只大鼠患上了 NASH，也即重度的 NAFLD。由此可见，E. fergusonii 可以导致数量可观的一部分大鼠患上重度 NAFLD。
图3 E. fergusonii可以导致数量可观的一部分大鼠患上重度 NAFLD，出现肝小叶炎症或肝组织纤维化。
大鼠实验：Escherichia fergusonii 可导致大鼠脂质代谢异常
在一些脂质代谢相关的生化指标上，E. fergusonii 喂食的大鼠也表现出和高脂高胆固醇喂食的大鼠相似的特征：血液中甘油三酯偏高，胆固醇偏高，餐后血糖偏高，低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）偏高，同型半胱氨酸偏高，胆酸偏高，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）偏低。
图4 E. fergusonii 喂食的大鼠也表现出和高脂高胆固醇喂食的大鼠相似的脂质代谢生化指标特征
在肝脏组织的基因表达水平上，qPCR 实验结果显示，E. fergusonii 喂食的大鼠在从头脂质合成（de novo lipogenesis）相关基因方面，表现出高表达的特征；而脂肪酸氧化、脂质周转、酮体生成、胆酸合成等相关的基因的表达则出现下降。其中，一个脂肪酸吸收、胆酸合成以及甘油三酯周转（triglyceride turnover）的关键调节基因 Pparα（Peroxisome proliferator-activated receptor α）的表达下降明显。
图5 E. fergusonii 喂食的大鼠的从头脂质合成相关基因表达上调（上方图）；而脂肪酸氧化、脂质周转、酮体生成、胆酸合成等相关的基因的表达下调（下方图）。
msRNA 测序：msRNA 23487 通过下调 PPARα 促进肝脏脂质积累
E. fergusonii 到底是为何会引发肝脏的脂质积累呢？近来有研究报道显示，细菌中存在 miRNA大小的小 RNA（miRNA-sized, small RNA，简称msRNA）可影响宿主的生理功能。因此，研究者在云序生物对 E. fergusonii 进行了细菌小 RNA（sRNA）测序。从 E. fergusonii 提取的总 RNA 中，选取大小符合 msRNA 标准的 RNA，并经过 sRNAscanner 预测，挑选出候选的 msRNA。对这些 msRNA 进行 GO 的 Biological Processes 分析，发现这些 E. fergusonii 来源的 msRNA 富集于宿主的肝脏代谢功能（包括肝脏的脂质代谢）相关的条目中。在这些候选的 msRNA当中，研究者选出了 miRDeep2 评分高、测序 Reads 数多、qPCR 定量表达水平高的msRNA 23487，并通过 BLAST 确认了 msRNA 23487 确实来自于细菌 E. fergusonii。
图6 候选 msRNA 富集于肝脏脂质代谢相关的 GO 条目中
图7 msRNA 23487 拥有miRDeep2 评分高、测序 Reads 数多、qPCR 定量表达水平高的特征。
miRanda 软件预测显示，PPARα 可能是 msRNA 23487 的靶基因。先前的大鼠实验中，E. fergusonii 喂食的大鼠的肝脏中，Western Blot 实验显示 PPARα 蛋白表达水平相比对照组确实有下降。为了验证这一现象，研究者向两个人类肝*细胞系 Huh7 和 HepG2 转染了 msRNA 23487 类似物，结果 PPARα 蛋白水平果然相比对照组有下降。先前已有研究发现，肝脏中的 PPARα 对于维持身体中脂肪酸的稳态具有重要作用，可以保护人体免于患上 NAFLD。在本研究中，msRNA 23487 转染的细胞系当中，果然在棕榈酸培养的环境中，积累了相比对照组细胞更多的脂质。综上可以得出结论，msRNA 23487 通过下调 PPARα 蛋白表达水平，促进了肝脏的脂质积累。
图8 Western Blot 实验结果显示，在E. fergusonii 或高脂高胆固醇喂食的大鼠的肝脏中，PPARα 蛋白的表达量相比对照组下降。
图9 在棕榈酸（PA）培养的环境中，msRNA 23487 转染的细胞系（PA-mimic）积累了相比对照组细胞更多的脂质。此图中所用细胞系为人肝*细胞系 HepG2。
小结
在这项研究当中，作者首先观察到了非肥胖的NAFLD 患者的肠道菌群中埃希氏菌比例的提升，随后在大鼠中验证了 E. fergusonii 喂食所引发的 NAFLD 病症。为了探明 E. fergusonii 引发 NAFLD 的分子机制，作者通过细菌sRNA 测序，筛选出了 msRNA 23487，并验证了这个 msRNA 对宿主的 PPARα蛋白表达的抑制作用。PPARα的下调降低了肝细胞的脂质氧化，导致了肝细胞的脂质积累，*终引发了非肥胖型的 NAFLD 的发生。
图10 E. fergusonii 引发肝脏脂质积累的原理
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