目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。在整个qPCR技术中，引物设计是非常重要的一环，它决定了扩增效率是否达标、扩增产物是否特异，最终决定我们的实验结果的好坏。而引物设计往往令很多科研工作者感到烦恼，无论是自己设计还是外包设计，总是担心引物效果不好，今天就给大家讲解一下引物设计的原理流程和特异性验证方法。

当我们在引物设计时，首先需要遵循许多原则。这些原则可以用来指导引物设计或者初步判断设计引物的好坏。

引物设计原则

1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性，模板链和扩增单链产物不能形成二级结构。

2. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度。

3. 引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

4. 引物的GC含量一般为40-60%，以45-55%为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。

5. 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右。（Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’端到3’端的下降形状也有利于引物引发聚合反应），至少要在55-80℃之间。

6. 碱基要随机分布，引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

7. 引物 3′ 端不要终止于密码子的第3位（密码子的第三位易发生简并）。

引物设计第一步：分析目的基因

在设计引物之前，我们需要对目的基因进行分析，我们需要明确目的基因的序列，以及序列信息，包括基因的内含子和外显子分布，以及不同的转录本有哪些，有没有信号肽序列等等。现在有很多引物设计网站和软件可以帮助大家进行引物设计，根据网站或者软件给出的各个备选引物，再结合上面的规则以及引物信息，就可以筛选出实验所需要的最佳引物。

接下来，我们以人的Bcl-2（B淋巴细胞瘤-2基因）基因为例，设计一对可以同时扩增其不同剪切变体的qPCR引物。首先，通过NCBI查询Bcl-2的基因结构，这里要注意对比基因名称、种属，确保都要一致。

Bcl-2有2个不同的转录本，一共有3个外显子区域，其中第1个和第2个外显子区域是共有的。

我们的目的是将不同的转录本都扩增出来，所以需要找到这些转录本的同源序列。可以看到，这个基因有多个不同的转录本，第一个转录本的第1、2个外显子区域是所有转录本的同源序列（红框内的绿色小竖线）。只需要将引物设在第1、2个外显子之间就可以满足实验需求。

在基因信息的页面下拉，就能看到该基因对应的mRNA和Protein信息，找到mRNA的序列号， 点击即可进入GenBank了。

点击第一个mRNA亚型的ID后，可以看到该亚型的详细信息，下拉后可以看到外显子信息，exon1的位置是1-596 bp，exon2的位置是597-1467 bp。（点击Highlight Sequence Features后，浏览器的下方就会出现选项，选择查看exon，这样也可以快速定位外显子的位置。）

确定位置后，向上拉网页，在右侧点击Pick Primers，就能直接进入Primer-Blast的页面进行引物设计了。

引物设计的第二步：生成引物

我们已经查到第1，2个外显子的位置是1-596和597-1467，在这两个区间设计引物，才能保证把所有的转录本都扩增出来。另外需要注意，qPCR的产物大小一般不超过300 bp，并且退火温度设置在57℃-63℃的范围内最佳，跨内含子的设计有助于辨别基因组DNA的污染，提高PCR产物的特异性。设置好这些参数后，点击Get Primers即可生成引物。

这时，NCBI就会弹出来告诉你，这样的参数选择会扩增到其他剪切变体，我们勾选不同的剪切变体并提交，就可以获得合适的引物对。

接下来网站给出了6对不同的PCR引物，理论上每一对都可以满足PCR的需求，实际操作时，大家还需要根据网站或软件对引物信息进行分析和筛选，才能最终确定合适的引物。

引物设计的第三步：引物特异性验证

其实，Primer-Blast除了可以设计引物外，还可以对我们自己设计的引物进行评估。返回引物设计的页面，输入我们设计好的上下游引物，其它参数可以不调整，提交后就可以看到这对引物是否在其它基因上也存在，如果全部都显示在我们想要扩增的基因中，则说明该引物特异性较强。例如引物 Primer pair 1的分析结果显示，该引物对可以同时扩增alpha和beta这2个转录本。

除了Primer-Blast以外还有很多其他的引物设计网站，例如Primer Bank（https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank）。打开Primer Bank的网站，在 Search by 的选项处下拉选择 GenBank Accession，Species 的选项处下拉选择Human，将mRNA的ID放在 For text 里面，然后点 Submit。

根据网站反馈的引物分析结果，在 Gene Description 那里再对一下基因信息，确定是自己想找的基因后，对生成的引物序列进行分析筛选后选择最佳引物用于后续实验。除了以上网站以外，常用的引物设计网站还有Primer3 Plus (http://www.primer3plus.com/),感兴趣的同学可以自行查询使用方法。

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